實(shí)驗(yàn)方法:
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。
細(xì)胞簡(jiǎn)介：
大鼠破骨細(xì)胞分離自骨組織和骨髓；破骨細(xì)胞是骨組織中的多核巨細(xì)胞，位于骨組織表面的淺凹處。目前一般認(rèn)為破骨細(xì)胞是分離自骨骼外的造血系統(tǒng)，其前體可能屬于造血干細(xì)胞的前單核細(xì)胞。破骨細(xì)胞的主要功能是維持骨吸收和骨形成的相對(duì)平衡，若失去這種平衡則發(fā)生病理性變化。因此多數(shù)學(xué)者從破骨細(xì)胞著手研究破骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能探討骨吸收，形成相互平衡的機(jī)制。但破骨細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，屬于不增殖細(xì)胞群，不能增殖和傳代，只能進(jìn)行原代培養(yǎng)且存活時(shí)間較短。
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組織來(lái)源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號(hào) |
用途 |
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骨髓 |
5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
A01X1654 |
僅供科研研究實(shí)驗(yàn) |
培養(yǎng)信息：
培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長(zhǎng)特性 貼壁
細(xì)胞形態(tài) 多核、巨細(xì)胞
傳代特性 屬于終末分化細(xì)胞；屬于不增殖細(xì)胞群
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡(jiǎn)介：
公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠破骨細(xì)胞采用機(jī)械分離法/密度梯度離心法和骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：
公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠破骨細(xì)胞經(jīng)TRAP染色檢測(cè)，純度可達(dá)30%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
大鼠趨化因子(FK)elisa檢測(cè)試劑盒免費(fèi)代測(cè)
大鼠β內(nèi)啡肽受體(β-EPR)elisa檢測(cè)試劑盒
小鼠親環(huán)素B(CYPB)elisa檢測(cè)試劑盒
人DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4樣蛋白(DDIT4/RTP801)elisa分析檢測(cè)試劑盒
組織AURORA-C激酶活性定量檢測(cè)試劑盒（A/B/C）
大鼠孕酮受體(PROGR)elisa檢測(cè)試劑盒免費(fèi)代測(cè)
INSULIN R-ALPHA 蛋白共沉淀分析試劑盒
小鼠α葡萄糖苷酶(α-glucosidase)elisa檢測(cè)試劑盒
β-半乳糖苷酶（β-GAL）測(cè)試盒
熱休克蛋白70蛋白4樣蛋白抗體 HSPA4L
溶血磷脂酶樣蛋白1抗體 LYPLAL1
IV型膠原α3結(jié)合蛋白抗體 COL4A3BP
KIAA1688蛋白抗體 KIAA1688
真核翻譯起始因子3K抗體 eIF3K
植烷酸氧化酶抗體 PHYHIP
鈣腔蛋白抗體 CALU
肝細(xì)胞源性纖維蛋白原相關(guān)蛋白1/FGL1抗體 HFREP1
細(xì)胞色素P450 4V2抗體 CYP4V2
細(xì)胞周期調(diào)控因子10抗體 CDC10
ZDHHC23蛋白抗體 ZDHHC23
β-葡萄糖腦苷脂酶抗體 GBA
ASCL2蛋白抗體 ASCL2
BEND3蛋白抗體 BEND3
跨膜蛋白Sema3C抗體 Sema3C
磷酸化HER4抗體 Phospho-HER4 (Tyr1284)
細(xì)胞熒光顯微鏡完全間接檢測(cè)試劑盒（含一抗和熒光二抗）
大鼠破骨細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染試劑 500μl
微型RNA（miRNA）定量擴(kuò)增分析試劑盒
ALAD; ALADH; ALADR; Aminolevulinate dehydratase; Aminolevulinate, delta, dehydratase; Delta aminolevulinic acid dehydratase; Delta-aminolevulinic acid dehydratase; HEM2_HUMAN; Lv; PBGS; Porphobilinogen synthase.
大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞
小鼠主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞
CW-2人結(jié)腸癌細(xì)胞
AR42J大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)具體步驟：
（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)使用無(wú)菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開(kāi)腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過(guò)的心臟破碎組織塊經(jīng)過(guò)離心后，可以用細(xì)頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過(guò)夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過(guò)夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細(xì)胞傳代：當(dāng)單個(gè)細(xì)胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進(jìn)行傳代，此時(shí)可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)正常細(xì)胞消化時(shí)間即可，當(dāng)然可以在消化過(guò)程中不斷管擦爬出細(xì)胞的皺縮情況，一旦達(dá)到消化完成（皺縮細(xì)胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個(gè)細(xì)胞時(shí)候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來(lái)，大概率是不會(huì)再貼壁成功啦。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細(xì)胞在傳代至代、第五代、第十代時(shí)候可以將部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細(xì)胞術(shù)等。