細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔毛囊干細(xì)胞分離自皮膚毛囊組織；毛囊是表皮細(xì)胞連續(xù)形成的袋樣上皮。其基底是真皮凹進(jìn)的真皮毛，中心是一根毛發(fā)，立毛肌的一側(cè)斜附在毛囊壁上，附著點(diǎn)的上方為皮脂腺通入毛囊的短頸，毛囊在皮膚表面的開(kāi)口是毛囊孔。毛囊位于真皮和皮下組織中，毛囊向下伸入真皮約有一厘米深度，它是由包繞毛發(fā)與表皮相連的上皮鞘，以及皮脂腺和立毛肌所組成的一個(gè)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的器官附件組織。毛囊干細(xì)胞是在毛囊外根鞘隆突部中的一種細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，在體內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)，在體外培養(yǎng)作用下表現(xiàn)出驚人的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，毛囊干細(xì)胞具有多向分化潛能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺，參與皮膚創(chuàng)傷的過(guò)程。毛囊干細(xì)胞和其它成體干細(xì)胞一樣，具有慢周期性、未分化性、自我更新和體外增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)。毛囊干細(xì)胞分化經(jīng)毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，F(xiàn)SC）、短暫增殖細(xì)胞（transit amplifying cells，TAC）有絲分裂后分化細(xì)胞（postmitotic differentiating cells，PDC）三個(gè)階段。毛囊干細(xì)胞在光鏡下呈立方形，細(xì)胞體積小，核漿比率大，表面光滑，皺褶少，又被稱為非鋸齒形細(xì)胞，細(xì)胞體積的增大與增殖能力呈負(fù)相關(guān)。超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞表面有少許微絨毛，細(xì)胞核存在許多卷曲，染色質(zhì)彌散分布，這些形態(tài)特征均表現(xiàn)出原始細(xì)胞的特性。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含FBS、EGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：梭形、多角形

傳代特性：可傳3代左右

消化液：0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔毛囊干細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶聯(lián)合消化制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔毛囊干細(xì)胞經(jīng)CD34熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

實(shí)驗(yàn)具體步驟：

（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)使用無(wú)菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開(kāi)腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過(guò)夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過(guò)夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；

實(shí)驗(yàn)方法:

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

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