實(shí)驗(yàn)方法:
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
細(xì)胞簡介：
兔支氣管上皮細(xì)胞分離自支氣管組織；支氣管（Bronchi），是指由氣管分出的各級(jí)分枝，由氣管分出的**支氣管，即左、右主支氣管。左主支氣管與右主支氣管相比較，前者較細(xì)長，走向傾斜；后者較粗短，走向較前者略直，所以經(jīng)氣管墮入的異物多進(jìn)入右主支氣管。支氣管和氣管還有以區(qū)別就是，氣管是以“C”型的氣管軟骨為支架，而支氣管不是。支氣管上皮是氣道與外界環(huán)境接觸的道防線，不僅是各種病原體、炎癥介質(zhì)作用的靶細(xì)胞，還作為效應(yīng)細(xì)胞合成、釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，從而參與氣道炎癥及反應(yīng)。支氣管上皮細(xì)胞在**、慢性阻塞性肺、肺癌、肺囊性纖維化以及一些感染性呼吸道的發(fā)病機(jī)制中均起著重要的作用。體外培養(yǎng)的原代支氣管上皮細(xì)胞因與體內(nèi)組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上存在很大的相似性，因此，在基礎(chǔ)及臨床研究中極為重要。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號(hào) |
用途 |
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支氣管 |
5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
A01X2013 |
僅供科研研究實(shí)驗(yàn) |
培養(yǎng)信息：
包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）
培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率：每2-3天換液一次
生長特性：貼壁
細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣
傳代特性：可傳1-2代
消化液：0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%
兔支氣管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。
方法簡介：
實(shí)驗(yàn)室分離的兔支氣管上皮細(xì)胞采用-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合機(jī)械刮刷并通過上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
實(shí)驗(yàn)室分離的兔支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)PCK熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
PPAR-γELISAKit
猴補(bǔ)體蛋白5(C5)elisa分析檢測試劑盒
C5 ELISA kit
人兒茶酚抑素elisa分析檢測試劑盒
HumancatestatinELISAKit
魚補(bǔ)體蛋白3(C3)elisa分析檢測試劑盒
大鼠鈣腔蛋白(CALU)elisa檢測試劑盒
細(xì)胞血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶（ACE）總活性比色法定量檢測試劑盒
人鵝膏蕈堿elisa檢測試劑盒
A型流感病毒核輸出蛋白抗體
Influenza A Nuclear export protein
22號(hào)染色體開放閱讀框40抗體
C22orf40
冰凍切片半胱-6（CASPASE-6）活性原位熒光染色檢測試劑盒
人c-sis elisa分析檢測試劑盒
大鼠P53elisa檢測試劑盒
小鼠前列腺素D2(PGD2)elisa檢測試劑盒
重組蛋白G抗體
Protein G
細(xì)胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)源蛋白43抗體
IFT43
神經(jīng)突起生長誘導(dǎo)因子受體Unc5a抗體 Anti-Unc5a/UNC5H1
足細(xì)胞表達(dá)蛋白/轉(zhuǎn)錄因子21抗體 Anti-POD1/TCF-21
絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基10抗體 Anti-PNUTS/PPP1R10
泛素相關(guān)修飾蛋白特異性蛋白酶5抗體 Anti-SENP5
辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG H&L
兔支氣管上皮細(xì)胞Donkey Anti-Rabbit IgG H&L / HRP
FRMD3蛋白抗體
MAR5; MART5; retrotransposon gag domain containing 4; Retrotransposon gag domain-containing protein 4; RGAG4; RGAG4_HUMAN; 6430402L03Rik; KIAA2001.
兔支氣管平滑肌細(xì)胞
兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
B16-F1 小鼠黑色素瘤細(xì)胞
HL-1小鼠心肌細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)具體步驟：
（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺(tái)使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細(xì)頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細(xì)胞傳代：當(dāng)單個(gè)細(xì)胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進(jìn)行傳代，此時(shí)可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)正常細(xì)胞消化時(shí)間即可，當(dāng)然可以在消化過程中不斷管擦爬出細(xì)胞的皺縮情況，一旦達(dá)到消化完成（皺縮細(xì)胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個(gè)細(xì)胞時(shí)候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會(huì)再貼壁成功啦。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細(xì)胞在傳代至代、第五代、第十代時(shí)候可以將部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細(xì)胞術(shù)等。