實驗方法:
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
細(xì)胞簡介：
小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自腦組織；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的主要組成成分，它是組成腦微血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞，能夠限制可溶性物質(zhì)和細(xì)胞等從血液進(jìn)入大腦，大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與外周內(nèi)皮細(xì)胞相比具有一些相同特性。它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在腦血管的發(fā)病機制中有重要病理生理學(xué)意義。與外周內(nèi)皮細(xì)胞相同，大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)細(xì)胞粘附分子，調(diào)控白細(xì)胞進(jìn)入大腦。由于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的器官特異性，內(nèi)皮細(xì)胞通常取源于研究的相關(guān)組織。其主要特征如下：①腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存在許多細(xì)胞間緊密連接，產(chǎn)生很高的跨內(nèi)皮阻抗，延遲細(xì)胞旁的通量；②腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺乏內(nèi)皮細(xì)胞的窗孔結(jié)構(gòu)，其液相物質(zhì)胞飲水平較低；③腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有不對稱定位酶和載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，從而產(chǎn)生“兩極分化”的表現(xiàn)型。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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腦組織 |
5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
A01X1943 |
僅供科研研究實驗 |
培養(yǎng)信息：
包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）
培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長特性 貼壁
細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣
傳代特性 可傳2-3代
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡介：
公司實驗室分離的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、后通過內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
公司實驗室分離的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CD31熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
PF/PFPELISAKit
植物維生素K1(VK1)elisa分析檢測試劑盒
VK1 ELISA Kit
人催乳素抑制(PIH)elisa分析檢測試劑盒
HumanPIHELISAKit
小鼠血小板生長因子(PDGF)elisa檢測試劑盒
大鼠粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)elisa檢測試劑盒
組織乙酰酯酶活性比色法定量檢測試劑盒
含L谷氨酰胺，不含丙酮酸鈉，含HEPES
KDELC2蛋白抗體
KDELC2
中心體蛋白89抗體
CEP89
人蛋白激酶C(PKC)elisa分析檢測試劑盒
細(xì)胞HSV2（HERPES SIMPLX2）病毒定量PCR擴增檢測試劑盒
輔酶Q10含量試劑盒
大鼠趨化因子9(CXCL9)elisa檢測試劑盒
RPS27A抗體
RPS27A
KRBA2蛋白抗體
KRBA2
S100鈣結(jié)合蛋白A11抗體 Anti-S100A11
對氧磷酶3抗體 Anti-PON3
前列環(huán)素受體抗體 Anti-Prostaglandin I2 Receptor
泛素硫酯酶L1+3抗體 Anti-UCHL1+3
膠體金標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG H&L
小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Goat Anti-Guinea Pig IgG H&L / Gold
β葡萄糖苷酶3抗體
C7orf24; CRF21; Cytochrome c-releasing factor 21; Gamma-glutamylcyclotransferase; Ggct; GGCT_HUMAN.
小鼠膀胱平滑肌細(xì)胞
兔三叉神經(jīng)元細(xì)胞
panc02小鼠胰腺癌細(xì)胞
IEC-6大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞
實驗具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細(xì)頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細(xì)胞傳代：當(dāng)單個細(xì)胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進(jìn)行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細(xì)胞，消化時間根據(jù)正常細(xì)胞消化時間即可，當(dāng)然可以在消化過程中不斷管擦爬出細(xì)胞的皺縮情況，一旦達(dá)到消化完成（皺縮細(xì)胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細(xì)胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細(xì)胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細(xì)胞術(shù)等。