實驗方法:
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
細胞簡介：
小鼠牙周膜成纖維細胞分離自牙周膜組織；牙周膜（牙周韌帶、牙周間隙）是由致密結締組織所構成。多數(shù)纖維排列成束，纖維的一端埋于牙骨質(zhì)內(nèi)，另一端則埋于牙槽窩骨壁里，使牙齒固位于牙槽窩內(nèi)；牙周膜內(nèi)有神經(jīng)、血管、和上皮細胞等。成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來。成纖維細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用。剛分離的牙周膜成纖維細胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細胞基本貼壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團；細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細胞質(zhì)透明，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。牙周膜成纖維細胞（PLFs）作為牙周膜的主體細胞，是牙周膜主要的間質(zhì)細胞，它不僅具有合成膠原、基質(zhì)、彈力纖維和糖蛋白的功能，還有吸收膠原吞噬異物的能力，還參與了牙周組織的病變、修復及再生過程。現(xiàn)在，利用牙周膜細胞建立體外模型，已經(jīng)成為有關員研究牙周組織的重要手段。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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牙周膜組織 |
5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶 |
A01X1979 |
僅供科研研究實驗 |
培養(yǎng)信息：
培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長特性 貼壁
細胞形態(tài) 成纖維細胞樣
傳代特性 可傳3代左右
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡介：
公司實驗室分離的小鼠牙周膜成纖維細胞采用膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
公司實驗室分離的小鼠牙周膜成纖維細胞經(jīng)Vimentin熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
小鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)elisa分析檢測試劑盒
小鼠CXC趨化因子13(Cxcl13/Blc/Scyb13)elisa檢測試劑盒
動物硬組織可溶性膜蛋白（粗提）制備試劑盒
細胞氧化應激活性氧超氧陰離子細胞流式儀檢測試劑盒
猴子白三烯C4(LTC4)elisa分析檢測試劑盒
植物茄呢醇磷酸酶1(SPS1/SPPS/SPS)elisa分析檢測試劑盒
大鼠維生素K1(VK1)elisa檢測試劑盒免費代測
熒光定量檢測試劑盒
小鼠70kDa熱休克蛋白8(HSPA8)elisa檢測試劑盒
溶質(zhì)載體家族蛋白25成員A26抗體 SLC25A26
三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運體3抗體 ABCA3/P180 Lamellar Body Protein
LIN7A蛋白抗體 LIN7A
METRNL蛋白抗體 METRNL
腫瘤/睪丸抗原74抗體 CT74
周期素D1重組兔單克隆抗體 Cyclin D1
高度相似的細胞周期蛋白激酶NEK6抗體 NEK6
谷草轉(zhuǎn)氨酶2抗體 GOT2
線粒體輔酶細胞色素C還原酶核心蛋白2抗體 UQCRC2
腺苷酸環(huán)化酶3抗體 ADCY3
癌基因RAS相關蛋白Rab4A抗體 RAB4
白細胞介素-10受體a抗體 IL-10RA
C2orf15抗體 C2orf15
CD85f抗體 LILRA5/CD85f
細胞抗原6重復位點蛋白G6F抗體 LY6G6F
磷酸化蛋白精氨酸N甲基4抗體 phospho-CARM1 (Ser228)
大鼠碳酸酐酶2(CA-2)elisa檢測試劑盒
小鼠牙周膜成纖維細胞豬甲狀腺素(T4)elisa檢測試劑盒免費代測
人皮質(zhì)醇（Cortisol）elisa檢測試劑盒
carcinoembryonic; Carcinoembryonic antigen CGM1; carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 3; Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3; cd66 d; CD66d; CEA; CEACAM 3; CEACAM-3; Ceacam3; CEAM 3; CEAM-3; CEAM3; CEAM3_HUMAN; CGM1; W264; W282.
小鼠牙周膜干細胞
兔頸動脈內(nèi)皮細胞
WB-F344(肝上皮樣干細胞)
KU812人外周血嗜堿性白血病細胞
實驗具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細胞傳代：當單個細胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細胞，消化時間根據(jù)正常細胞消化時間即可，當然可以在消化過程中不斷管擦爬出細胞的皺縮情況，一旦達到消化完成（皺縮細胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細胞數(shù)量種植到對應的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細胞進行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細胞術等。