實(shí)驗(yàn)方法:
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。
細(xì)胞簡(jiǎn)介：
髓核是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，為椎間盤結(jié)構(gòu)的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間。由縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細(xì)胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。
髓核細(xì)胞的過(guò)早衰老與凋亡是導(dǎo)致椎間盤退行性變過(guò)程的主要原因之一，主要表現(xiàn)為退變椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞功能降低和數(shù)量減少，使得其 Ⅱ型膠蛋白聚糖等基質(zhì)分泌量下降，終導(dǎo)致椎間盤維持脊柱高度、承受各方應(yīng)力等生物力學(xué)功能喪失。
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組織來(lái)源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號(hào) |
用途 |
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椎間盤組織 |
5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
A01X2145 |
僅供科研研究實(shí)驗(yàn) |
細(xì)胞特性：
1）組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常椎間盤組織。
2)細(xì)胞鑒定：Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)熒光染色為陽(yáng)性。
3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、、酵母和。
5)細(xì)胞生長(zhǎng)方式：梭形或多角形細(xì)胞，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
推薦培養(yǎng)基
我們推薦使用 DELF 原代 軟骨 細(xì) 胞培養(yǎng)體系 作為體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
公司正在出售的產(chǎn)品：
小鼠白介素31(IL-31)elisa檢測(cè)試劑盒
人醛固酮（ALD）elisa檢測(cè)試劑盒
酵母菌YNB培養(yǎng)基
魚球蛋白A(IgA)elisa分析檢測(cè)試劑盒
大鼠雙氫睪酮(DHT)elisa檢測(cè)試劑盒
冰凍切片淀粉樣蛋白（AMYLOID）染色試劑盒
人β血小板球蛋白/β血栓環(huán)蛋白(β-TG)elisa檢測(cè)試劑盒
大鼠白三烯C4(LTC4)elisa分析檢測(cè)試劑盒
小鼠纖溶酶原激活劑抑制物（PAI-1）elisa檢測(cè)試劑盒
DNAJC11蛋白抗體 DNAJC11
D型-過(guò)氧化酶活化受體抗體 PPAR delta + beta
磷酸化鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2α抗體 phospho-CaMK2 alpha (Tyr230)
磷酸化酶激酶γ1 PHKG1
表皮細(xì)胞表面抗原1/Esa1抗體 Flotillin 2
叉頭蛋白S1抗體 FOXS1
腺苷酸活化蛋白激酶γ1抗體 AMPK gamma 1
鋅指蛋白142抗體 ZNF142
OTUD1蛋白抗體 OTUD1
PE-Cy5標(biāo)記人CD55單克隆抗體 human CD55/PE-Cy5
神經(jīng)母細(xì)胞瘤源性分泌蛋白抗體 C1orf76
神經(jīng)元核抗原抗體 NeuN
核糖核酸結(jié)合蛋白2抗體 PTBP2
黑色素瘤相關(guān)突變抗原1樣蛋白1抗體 MUM1L1
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1 TAK1
自噬相關(guān)蛋白9B抗體 ATG9B
大鼠過(guò)氧化物酶體生物合成因子2(PEX2)elisa檢測(cè)試劑盒
兔髓核細(xì)胞IL-6 ELISA KIT
人基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP-12)elisa分析檢測(cè)試劑盒
EAP1; EXOS7_HUMAN; Exosc7; Exosome complex component RRP42; Exosome complex exonuclease RRP42; Exosome component 7; FLJ26543; hRrp42p; KIAA0116; p8; Ribosomal RNA processing protein 42; Ribosomal RNA-processing protein 42; RRP42; Rrp42p.
兔髓核細(xì)胞
大鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞
小鼠精母細(xì)胞；GC-2 spg （種屬鑒定）
T24人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)具體步驟：
（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)使用無(wú)菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過(guò)的心臟破碎組織塊經(jīng)過(guò)離心后，可以用細(xì)頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過(guò)夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過(guò)夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細(xì)胞傳代：當(dāng)單個(gè)細(xì)胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進(jìn)行傳代，此時(shí)可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)正常細(xì)胞消化時(shí)間即可，當(dāng)然可以在消化過(guò)程中不斷管擦爬出細(xì)胞的皺縮情況，一旦達(dá)到消化完成（皺縮細(xì)胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個(gè)細(xì)胞時(shí)候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來(lái)，大概率是不會(huì)再貼壁成功啦。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細(xì)胞在傳代至代、第五代、第十代時(shí)候可以將部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細(xì)胞術(shù)等。