1．模板變性溫度 

變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后zui高變性溫度不宜超過95℃。

2．引物退火溫度

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的zui適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 　　其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果（G+C）%含量為50%時，則Ta的起點可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。

 3．引物延伸溫度

溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的zui適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡便的雙溫循環(huán)是行之有效的。