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PCR反應(yīng)引物二聚體控制解析
日期：2024-10-23 02:07
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摘要：
如果出現(xiàn)了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。
1、首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下，兩步循環(huán) (由 95°C 變性步驟直接進(jìn)入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。
2、可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想終濃度為 200 nM，但如有需要...
如果出現(xiàn)了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。
1、首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下，兩步循環(huán) (由 95°C 變性步驟直接進(jìn)入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。
2、可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。
3、鎂的佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。
4、如果未對(duì)引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評(píng)估，則應(yīng)補(bǔ)充評(píng)估并考慮重新設(shè)計(jì) (如有需要)。通常情況下，使用熱啟動(dòng) DNA 聚合酶，并在冰上進(jìn)行反應(yīng)。
5、在理論上，針對(duì)同一靶點(diǎn)應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)引物組。這實(shí)際上可以節(jié)省大量時(shí)間，因?yàn)槿绻@些引物中的一個(gè)能立即發(fā)揮作用，則可以減少花費(fèi)在優(yōu)化過(guò)程上的時(shí)間。