引物是決定 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在 PCR 反應(yīng)中極為重要。要保證 PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：

⑴ 引物的長(zhǎng)度以 15-30bp 為宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)是隨機(jī)的。

⑵ 引物的 3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在 3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于 5 個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過(guò) 3 個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。

⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng) PAGE 或離子交換 HPLC 進(jìn)行純化。

⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過(guò)高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說(shuō)來(lái)，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。

⑸ 引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中

一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。