貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)具體過(guò)程：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。

3. 輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

4 . 收到細(xì)胞后首 次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。

5.貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)必須仔細(xì)監(jiān)測(cè)以確保細(xì)胞保持健康。根據(jù)細(xì)胞類型，很多貼壁細(xì)胞在其達(dá)到70-90%密度，也就是覆蓋了培養(yǎng)容器表面的70-90%時(shí)需要傳代。

這些細(xì)胞系雖然保留了原細(xì)胞源的很多特征，但是每次傳代也會(huì)使它們開始產(chǎn)生一些擴(kuò)增細(xì)胞的特有特性。因此，對(duì)任何一個(gè)特定細(xì)胞系，要考慮限制傳代的次數(shù)。

6.很多貼壁細(xì)胞系可天然附著于無(wú)涂層的塑料上。因此，塑料細(xì)胞培養(yǎng)板如培養(yǎng)皿或六孔板經(jīng)常用于傳代細(xì)胞。塑料的細(xì)胞培養(yǎng)瓶也經(jīng)常用到，如T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，常用于擴(kuò)增培養(yǎng)數(shù)目少的細(xì)胞或者開始培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞系。T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶常用在培養(yǎng)擴(kuò)增速度較快的細(xì)胞系或用于生長(zhǎng)超過(guò)T25培養(yǎng)瓶容量的大量細(xì)胞。

7.在轉(zhuǎn)移貼壁細(xì)胞時(shí)，要先剪切掉細(xì)胞上與和塑料結(jié)合的蛋白。因此，消化酶胰酶常用于消化細(xì)胞?？刂埔让赶臅r(shí)間很重要，因?yàn)槿绻幚頃r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損壞細(xì)胞表面的蛋白。

8.細(xì)胞培養(yǎng)液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸緩沖液或PBS洗滌細(xì)胞。EDTA，一種鈣螯合劑有時(shí)候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。

9.為擴(kuò)增細(xì)胞克隆，將新鮮傳代的細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，選擇適合該細(xì)胞生長(zhǎng)條件，通常為溫度37度，二氧化碳5％和濕度95%