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產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號(hào)
兔NK細(xì)胞	詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)	FS-016462

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

主要功能：

（1）血管平滑肌細(xì)胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素。

（2）表達(dá)鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應(yīng)。

（3）與血管的進(jìn)展和穩(wěn)定有關(guān)。

 生理變化：

（1）主動(dòng)脈硬化。

（2）主動(dòng)脈瘤

（3）主動(dòng)脈鈣化。

基本特性：

（1）組織來(lái)源于正常大鼠大動(dòng)脈組織。

（2）鑒定：肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色。

（3）原代細(xì)胞培養(yǎng)末期液氮凍存。

（4）每?jī)龃婀芗?xì)胞數(shù)：>5×105 cells/1ml。

（5）肌動(dòng)蛋白，alpha-SMA和Desmin熒光染色驗(yàn)證。

（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原體、酵母。

培養(yǎng)步驟：

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

半胱氨酸蛋白酶1 Casp-1 Caspase 1 3.125 100 pg/mL 0.1

半胱氨酸蛋白酶3 Casp-3 Caspase 3 1.5 48 pmol/L 0.1

半胱氨酸蛋白酶8 Casp-8 Caspase 8 3.75 120 pmol/L 0.1

半胱氨酸蛋白酶9 Casp-9 Caspase 9 2 64 pmol/L 0.1

半胱氨酸蛋白酶抑制劑;胱抑素C Cys-C Cystatin C 50 1600 ng/mL 10

半乳甘露聚糖 GM Galactomannan 20 640 pg/mL 1

半乳糖凝集素1 Galectin-1 Galectin-1 1.25 40 ng/mL 0.1

半乳糖凝集素2 Galectin-2 Galectin-2 2.5 80 pg/mL 0.1

半乳糖凝集素3 Galectin-3 Galectin-3 0.5 16 ng/mL 0.1

半乳糖凝集素9 Gal-9 Galectin-9 3.125 100 pg/mL 0.1

胞漿型磷脂酶A2 cPLA2 cytosolic phospholipase A2 31.25 1000 pg/mL 1

胞外超氧化物歧化酶 SOD3 Super Oxidase Dimutase 3 10 320 U/mL 1

飽腹因子 CART cocaine- andamphetamine-regulatedtranscript 0.5 16 ng/mL 0.1

吡啶交聯(lián)物 PY pyridinium crosslink;PyriLinks 0.25 8 ng/mL 0.1

表面活性蛋白A SP-A Surfactant Protein A 6.25 200 pg/mL 1

表面活性蛋白D SP-D Surfactant Protein D 2.5 80 ng/mL 0.1

表皮生長(zhǎng)因子 EGF Epidermal growth factor 15 480 pg/mL 1

總表皮生長(zhǎng)因子受體 T-EGFR Total epidermal growth factor receptor 1 32 ng/mL 0.1

表皮生長(zhǎng)因子受體2 Her2 Epidermal growth factor receptor 2 0.5 16 ng/mL 0.1

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ALT Alanine Aminotransferase 2 64 U/L 0.1

丙二醛 MDA malondialchehyche 0.25 8 nmol/mL 0.1

丙酮醛 MGO Methylglyoxal 3.75 120 ng/mL 0.1

丙酮酸激酶M2型同工酶 M2-PK Pyruvate Kinase 0.5 16 U/mL 0.1

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 鼠單抗 FCM    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 鼠單抗 50 μL

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

Dkk3 / REIC 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 μg

Dkk3 / REIC 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔單抗 IHC-P    50 μg

Nos3 / eNOS 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB    50 μg

Dkk3 / REIC 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA   WB  IHC-P   IF  ICC/IF    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA   WB  IHC-P   IHC-Fr   50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

UCHL3 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔單抗 WB   IP    50 μg

CD16 / FCGR3 抗體, 兔單抗 FCM    50 μg

ITGA5 & ITGB1 Heterodimer 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

ITGA6 & ITGB1 Heterodimer 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM    25 Test

ITGA5 & ITGB1 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

兔NK細(xì)胞TGA5 & ITGB1 抗體, 鼠單抗 IF   ICC/IF    50 μg

ITGA6 & ITGB1 Heterodimer 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

ITGA6 & ITGB1 Heterodimer 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)*易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。