細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞分離自眼角膜組織；角膜位于眼球前壁的一層透明膜，約占纖維膜的前1/6，從后面看角膜呈正圓形，從前面看為橫橢圓形。角膜厚度各部分不盡相同，中央部薄。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢，如有外物接觸角膜，眼瞼便會(huì)不由自主地合上以保護(hù)眼睛。為了保持透明，角膜并沒(méi)有血管，透過(guò)外界空氣、淚液及房水獲取養(yǎng)份及氧氣。角膜分為五層，由前向后依次為：上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層、內(nèi)皮細(xì)胞層。角膜的高度透明性和光學(xué)性是正常發(fā)揮生理功能的必要條件之一，而角膜內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）在維持角膜的正常生理功能方面起重要作用。角膜內(nèi)皮細(xì)胞是角膜內(nèi)層的單層細(xì)胞，構(gòu)成了后彈力層和房水之間的物理屏障，通過(guò)離子“泵”功能調(diào)節(jié)角膜中離子濃度和水分，維持角膜的半脫水狀態(tài)，保證角膜的正常厚度和透明度。一旦角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能出現(xiàn)紊亂，常導(dǎo)致角膜水腫而使角膜部分甚至完全失去透明性。角膜內(nèi)皮細(xì)胞主要功能有：①角膜是的無(wú)血管的組織，具有透明的特性和合成許多蛋白的功能；②角膜內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)角膜透明性有重要作用；③角膜內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)Na+-K+-ATP酶活性，維持角膜和房水內(nèi)Na+梯度，防止水分滲入角膜內(nèi)，維持角膜實(shí)質(zhì)層相對(duì)脫水狀態(tài)，維持透明性。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳2-3代

消化液 0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞采用混合膠原酶消化結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

實(shí)驗(yàn)具體步驟：

（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)使用無(wú)菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開(kāi)腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過(guò)夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過(guò)夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；

實(shí)驗(yàn)方法:

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

公司正在出售的產(chǎn)品：