實(shí)驗(yàn)方法:
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡便、快速，但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
細(xì)胞簡介：
大鼠腮腺細(xì)胞分離自腮腺組織；腮腺是哺乳類動物口腔中位于下頜角處的大唾液腺，位于外耳道的前下方，下頜后窩內(nèi)及下頜支的深面。腮腺也是某些無尾目動物頸部有毒皮膚腺的聚集體；唾液腺有3對，腮腺、舌下腺和頜下腺，其中大的一對是腮腺。腮腺細(xì)胞是高度分化的上皮源性細(xì)胞，是一種營養(yǎng)需要復(fù)雜、在一般合成培養(yǎng)基中不易生長，體外培養(yǎng)比較困難。目前，DMEM培養(yǎng)液被認(rèn)為較適于腺細(xì)胞的培養(yǎng)。加入一定量的血清更有利于細(xì)胞的生長、增殖與分化。另外，接種的細(xì)胞密度也是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一，尤其是在腺細(xì)胞這種單層細(xì)胞培養(yǎng)時，接種的細(xì)胞總數(shù)量和生長基質(zhì)表面的細(xì)胞密度對整個細(xì)胞的生長均有影響。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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腮腺組織 |
5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 |
A01X1620 |
僅供科研研究實(shí)驗(yàn) |
培養(yǎng)信息：
培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長特性 貼壁
細(xì)胞形態(tài) 梭形、多角形
傳代特性 可傳1-2代
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡介：
公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠腮腺細(xì)胞采用膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化后差速貼壁，結(jié)合上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠腮腺細(xì)胞經(jīng)PCK熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
MIP-3βELISAkit
大鼠6酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)elisa分析檢測試劑盒
Rat 6-K-PGF1a ELISA Kit
人甘膽酸(CG)elisa分析檢測試劑盒
CGELISAKit
小鼠V-Erb小鼠B2紅白血病病毒癌基因源物3(ErbB3)elisa檢測試劑盒
N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）含量測試盒
石蠟切片組織TRAIL 蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒
綿羊3-硝基(3-NT)elisa檢測試劑盒
硫酸乙酰肝素6腦苷脂轉(zhuǎn)硫酸酶1抗體
HS6ST1
丙型肝炎病毒核結(jié)合蛋白-1抗體
ACY3
人白介素31(IL-31)elisa檢測試劑盒
細(xì)胞脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（LP PLA2）活性比色法定量檢測試劑盒
小鼠血栓素B2(TXB2)elisa檢測試劑盒
大鼠可溶性瘦素受體(sLR)elisa檢測試劑盒
鈣粘蛋白LKC抗體
PCLKC
膀胱癌突變蛋白1抗體
CCDC112
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44抗體 Anti-TXNDC4/ERP44
前細(xì)胞脹亡受體誘導(dǎo)膜損傷蛋白抗體 Anti-Porimin
核纖層蛋白A相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白1抗體 Anti-PAS1C1
分泌模塊化鈣結(jié)合蛋白2抗體（平滑肌相關(guān)蛋白2） Anti-SMOC2
FITC標(biāo)記的驢抗豚鼠IgG H&L
大鼠腮腺細(xì)胞Donkey Anti-Guinea Pig IgG H&L / FITC
線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶抗體
BMP 15; BMP-15; BMP15; BMP15_HUMAN; Bone morphogenetic protein 15; GDF 9B; GDF-9B; GDF9B; Growth/differentiation factor 9B; ODG2; POF4.
大鼠三叉神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞
小鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞
Eca-109人食管癌細(xì)胞
B16-F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細(xì)頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細(xì)胞傳代：當(dāng)單個細(xì)胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進(jìn)行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細(xì)胞，消化時間根據(jù)正常細(xì)胞消化時間即可，當(dāng)然可以在消化過程中不斷管擦爬出細(xì)胞的皺縮情況，一旦達(dá)到消化完成（皺縮細(xì)胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細(xì)胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細(xì)胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細(xì)胞術(shù)等。