實(shí)驗(yàn)方法:

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡便、快速，但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。

細(xì)胞簡介：

兔附睪上皮細(xì)胞分離自附睪組織；附睪（Epididymis）是一個由曲折、細(xì)小的管子構(gòu)成的器官，一端接著輸精管（Ductusdeferens），一端接著睪丸（Testis）的曲細(xì)精管，具體結(jié)構(gòu)主要包括輸出小管和附睪管。附睪緊貼睪丸的上端和后緣，可分為頭、體、尾三部。精子離開睪丸后通過輸出小管進(jìn)入附睪。附睪具有暫存精液并分泌附睪液營養(yǎng)精子的功能，以促進(jìn)精子的進(jìn)一步成熟附睪的功能是暫存精子，促進(jìn)精子的進(jìn)一步成熟。精子在附睪內(nèi)獲得運(yùn)動能力，總共停留8～17天，終達(dá)到功能上的成熟。在這個過程中，精子除了自身的因素，還受到附睪微環(huán)境的影響，這包括了一系列的物理、化學(xué)變化和精子形態(tài)的改變?？梢哉f，附睪微環(huán)境正常穩(wěn)定是附睪發(fā)揮促成熟這一功能的必要條件。若附睪的功能發(fā)生異常，精子則不能成熟，引起不育。附睪上皮含有主細(xì)胞、基細(xì)胞、亮細(xì)胞等幾種類型細(xì)胞?；?xì)胞，其頂部離附睪管腔有一定距離，在附睪各部分，其形態(tài)沒有差別，一般認(rèn)為是貯備細(xì)胞；另一種主細(xì)胞，是維持附睪生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，在各區(qū)段的主細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)差別很大，這也反映出各區(qū)段的生理功能的差異。除上皮細(xì)胞外，附睪的管壁組織結(jié)構(gòu)也有規(guī)律性的變化，附睪管起始段平滑肌有自發(fā)地節(jié)律性收縮，而尾部平滑肌就沒有這種特點(diǎn)，僅在射精一瞬間出現(xiàn)強(qiáng)烈的節(jié)律收縮。作為負(fù)責(zé)提供適合精子成熟微環(huán)境的附睪，具有活躍的分泌與吸收功能。其中，附睪上皮的電解質(zhì)和水分的轉(zhuǎn)運(yùn)，對保持附睪內(nèi)合適的離子濃度和酸堿度，為精子成熟提供適宜的環(huán)境起著相當(dāng)重要的作用。睪丸的支持細(xì)胞每天能產(chǎn)生大量睪網(wǎng)液，如一只公羊每天約能分泌40毫升睪網(wǎng)液，而從附睪排出的只不過幾百微升，也就是說睪丸分泌液有99%被附睪上皮重新吸收回體內(nèi)。動物實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)扎輸精管時(shí)睪丸不會腫脹，但若結(jié)扎睪丸輸出小管，睪丸天就會腫脹，這就充分證實(shí)了附睪存在著強(qiáng)有力的吸收功能，但是重新吸收的意義尚不清楚。體外培養(yǎng)附睪上皮細(xì)胞對精子的發(fā)育、成熟，不孕不育，附睪生理基礎(chǔ)功能研究具有重要意義。

培養(yǎng)信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基：含FBS、EGF、Hydrocortisone、腎上腺素、甲狀腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔附睪上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培吒?吒

方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔附睪上皮細(xì)胞采用膠原酶消化結(jié)合差速貼壁法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔附睪上皮細(xì)胞經(jīng)PCK熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

公司正在出售的產(chǎn)品：

實(shí)驗(yàn)具體步驟：

（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；

（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；