實驗方法:
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
細胞簡介：
兔骨骼肌細胞分離自四肢肌肉組織；骨骼肌又稱橫紋肌，肌肉中的一種，約占全身重量的40%。骨骼肌纖維為長柱形的多核細胞，肌膜的外面有基膜緊密貼附。屬于橫紋肌，橫紋肌還包括心肌與內(nèi)臟橫紋肌，其中骨骼肌主要分布于四肢。每塊肌肉都是具有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的器官，有豐富的血管、分布，在軀體神經(jīng)支配下收縮或舒張，進行隨意運動。肌肉可根據(jù)共形狀、大小、位置、起止點、纖維方向和作用等命名。依形態(tài)命名的如斜方肌、菱形肌、三角肌、梨狀肌等。骨骼肌細胞呈纖維狀，不分支，有明顯橫紋，核很多，且都位于細胞膜下方。肌細胞內(nèi)有許多沿細胞長軸平行排列的細絲狀肌原纖維。每一肌原纖維都有相間排列的明帶（Ⅰ帶）及暗帶（A帶）。明帶染色較淺，而暗帶染色較深。暗帶中間有一條較明亮的線稱H線。H線的中部有一M線。明帶中間，有一條較暗的線稱為Z線。兩個Z線之間的區(qū)段，叫做一個肌節(jié)。骨骼肌細胞也稱橫紋肌細胞，細胞呈纖維狀，不分支，有明顯橫紋，核很多，且都位于細胞膜下方，細胞多呈梭行，具有一定的方向性。骨骼肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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骨骼肌組織 |
5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶 |
A01X2142 |
僅供科研研究實驗 |
培養(yǎng)信息：
包被條件 PLL（0.1mg/ml）
培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長特性 貼壁
細胞形態(tài) 成纖維細胞樣
傳代特性 可傳2-3代
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡介：
公司實驗室分離的兔骨骼肌細胞采用膠原酶消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
公司實驗室分離的兔骨骼肌細胞經(jīng)α-Sarcometric actin熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
大鼠抑瘤素M受體(OSMR)elisa檢測試劑盒
大鼠過氧化脂質(zhì)/乳過氧化物酶(LPO)elisa檢測試劑盒
小鼠轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)elisa檢測試劑盒
人促睡眠肽(DSIP)elisa檢測試劑盒
（Vibrio cholerae）鑒定
小鼠穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)elisa檢測試劑盒
大鼠CD8分子(CD8)elisa分析檢測試劑盒
C. parapsilosis RFLP基因分析試劑盒
人B群鏈球菌多糖抗體(IgG)elisa分析檢測試劑盒
煙堿型乙酰膽堿受體α9/AChRα9抗體 CHRNA9
胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6抗體 IGFBP6
電壓依賴性鈣通道Cav3.1抗體 CACNA1G
多囊腎蛋白1樣蛋白2抗體 PKD1L2
FITC標記小鼠CD122單克隆抗體 mouse CD122/FITC
F肌動蛋白α2亞基抗體 CAPZA2
氯離子通道調(diào)節(jié)蛋白1A抗體 CLNS1A
膜型卷曲相關(guān)蛋白MFRP抗體 MFRP
5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白抗體 Serotonin transporter
9號染色體開放閱讀框43抗體 C9ORF43
甲基化樣蛋白21C抗體 METTL21C
間隙連接蛋白26/GJB2抗體 Connexin 26
Rho GTP酶激活蛋白13抗體 SRGAP1
S2P內(nèi)肽酶抗體 Site 2 protease
髓鞘蛋白P0樣蛋白1抗體 MPZL
源異型盒基因HOXA13抗體 HOXA13
細胞NAD依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶（NAD-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase；NAD-GAPDH）活性光譜法定量檢測試劑盒
兔骨骼肌細胞人CC趨化因子受體1(CCR1)elisa分析檢測試劑盒
大鼠DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)elisa檢測試劑盒
A6; A6 protein tyrosine kinase; Protein A6; Protein tyrosine kinase 9; PTK9; PTK9 protein tyrosine kinase 9; TWF 1; TWF1; Twinfilin 1; Twinfilin actin binding protein, homolog 1; Twinfilin; Twinfilin, actin-binding protein, homolog 1 (Drosophila); Twinfilin, Drosophila, homolog of, 1; TWF1_HUMAN; Twinfilin-1.
兔骨髓單核細胞
小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞
PC-3人前列腺癌
GBC-SD 人膽囊癌細胞
實驗具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細胞傳代：當單個細胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細胞，消化時間根據(jù)正常細胞消化時間即可，當然可以在消化過程中不斷管擦爬出細胞的皺縮情況，一旦達到消化完成（皺縮細胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細胞數(shù)量種植到對應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細胞進行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細胞術(shù)等。