實驗方法:
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
細胞簡介：
兔腦微血管內(nèi)皮細胞分離自腦組織；腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的主要組成成分，它是組成腦微血管腔面單層扁平上皮樣細胞，能夠限制可溶性物質(zhì)和細胞等從血液進入大腦，大腦微血管內(nèi)皮細胞與外周內(nèi)皮細胞相比具有一些相同特性。它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在腦血管的發(fā)病機制中有重要病理生理學(xué)意義。與外周內(nèi)皮細胞相同，大腦微血管內(nèi)皮細胞表面表達細胞粘附分子，調(diào)控白細胞進入大腦。由于微血管內(nèi)皮細胞的器官特異性，內(nèi)皮細胞通常取源于研究的相關(guān)組織。其主要特征如下：①腦微血管內(nèi)皮細胞存在許多細胞間緊密連接，產(chǎn)生很高的跨內(nèi)皮阻抗，延遲細胞旁的通量；②腦微血管內(nèi)皮細胞缺乏內(nèi)皮細胞的窗孔結(jié)構(gòu)，其液相物質(zhì)胞飲水平較低；③腦微血管內(nèi)皮細胞具有不對稱定位酶和載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，從而產(chǎn)生“兩極分化”的表現(xiàn)型。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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腦 |
5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶 |
A01X2189 |
僅供科研研究實驗 |
培養(yǎng)信息：
包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）
培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率：每2-3天換液一次
生長特性：貼壁
細胞形態(tài)：內(nèi)皮細胞樣
傳代特性：可傳2-3代
消化液：0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%
兔腦微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。
方法簡介：
實驗室分離的兔腦微血管內(nèi)皮細胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、后通過內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
實驗室分離的兔腦微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)CD31熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
OFQ/NELISAKit
倉鼠促卵泡素(FSH)elisa分析檢測試劑盒
FSH ELISA kit
人凋亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)elisa分析檢測試劑盒
HumanDAPKELISAKit
小鼠高爾基蛋白73(GP-73)elisa檢測試劑盒
大鼠δ氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)elisa檢測試劑盒
血液甘油三酯（triglyceride）含量酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)比色法
人SH2攜帶蛋白(SHC/SLP-76)elisa檢測試劑盒
IPPK蛋白抗體
IPPK
β淀粉樣蛋白前體結(jié)合蛋白B-1抗體
APBB1 interacting protein 1
血液維生素B1高效液相色譜法定量檢測試劑盒
小鼠TATA框結(jié)合蛋白關(guān)聯(lián)因子12(TAF12)elisa檢測試劑盒
大鼠胰島素樣生長因子2(IGF-2)elisa檢測試劑盒
DAP KINASE蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒
G蛋白偶聯(lián)受體RAB23抗體
RAB23
肽B/天蠶肽B抗體
Cecropin B
泛素激活酶2H抗體 Anti-Ube2H/UBCH2
早老素γ分泌酶2抗體 Anti-PEN2
磷脂酰肌醇激酶（PI3Kβ）抗體 Anti-PI3 Kinase p110 beta
S100A4抗體 Anti-S100A4
PE-Cy5.5標(biāo)記的驢抗羊IgG H&L
兔腦微血管內(nèi)皮細胞Donkey Anti-Goat IgG H&L / PE-Cy5.5
ZDBF2蛋白抗體
Hemopoietic lineage switch protein 5; HLS5; KIAA1098; Macrophage derived apoptosis inducing RBCC protein; MAIR; NC8; Protein MAIR; Protein Nc8; Tripartite motif containing 35; Tripartite motif containing protein 35; TRI35_HUMAN.
兔膀胱平滑肌細胞
小鼠腹膜間皮細胞
SK-NEP-1人腎母細胞瘤細胞
HCC -1359人乳腺癌細胞
實驗具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細胞傳代：當(dāng)單個細胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細胞，消化時間根據(jù)正常細胞消化時間即可，當(dāng)然可以在消化過程中不斷管擦爬出細胞的皺縮情況，一旦達到消化完成（皺縮細胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細胞數(shù)量種植到對應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細胞進行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細胞術(shù)等。