實(shí)驗(yàn)方法:

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離自臍帶；臍帶是哺乳類的連接胎兒和胎盤(pán)的管狀結(jié)構(gòu)。原來(lái)是由羊膜包卷著卵黃囊和尿膜的柄狀伸長(zhǎng)部而形成的。臍帶中通過(guò)尿膜的血管即臍動(dòng)脈和臍靜脈，卵黃囊的血管即臍腸系膜動(dòng)脈及臍腸系膜靜脈。當(dāng)卵黃囊及其血管退化，臍動(dòng)脈和臍靜脈就發(fā)達(dá)起來(lái)，在這些間隙中可以看到疏松的膠狀的間充質(zhì)。在中，動(dòng)脈在胎盤(pán)的母體部分出的，與胎盤(pán)的子體部胎兒靠近，在此處母體和胎兒的血液間進(jìn)行CO2和O2，代謝產(chǎn)物即代謝廢物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。臍動(dòng)脈將胎兒來(lái)的廢物運(yùn)送至胎盤(pán)，臍靜脈將O2和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胎盤(pán)運(yùn)送給胎兒。后由靜脈將來(lái)自胎兒的代謝廢物運(yùn)走，某種和抗體等也通過(guò)臍帶從母體移交給胎兒。臍帶中含有大量的干細(xì)胞，干細(xì)胞是生命的種子，它會(huì)分化成機(jī)體的各種細(xì)胞，結(jié)出各種不同的果實(shí)——血液細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼細(xì)胞等。干細(xì)胞是具有自我更新、高度增殖和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞群體；這些細(xì)胞可以通過(guò)分裂維持自身細(xì)胞的特性和數(shù)量，又可進(jìn)一步分化為各種組織細(xì)胞，從而在組織修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一種具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞。在不同的誘導(dǎo)條件下，可分化為多種造血細(xì)胞以外的組織細(xì)胞，并具有造血支持、調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等作用；目前，多用于風(fēng)濕的。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，存在于骨髓、脂肪組織、臍血及多種胎兒組織。它可分泌多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，促進(jìn)造血干細(xì)胞（HSC）的增殖與分化。MSCs還具有調(diào)節(jié)、和組織修復(fù)作用，可減輕移植物抗宿主?。℅VHD）及其他移植相關(guān)并發(fā)癥。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳3-5代左右

消化液 0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用組織貼塊法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)CD90熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

公司正在出售的產(chǎn)品：

實(shí)驗(yàn)具體步驟：

（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；

（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)使用無(wú)菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開(kāi)腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過(guò)夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過(guò)夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；