細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自視網(wǎng)膜組織；視網(wǎng)膜居于眼球壁的內(nèi)層，是一層透明的薄膜。視網(wǎng)膜由色素上皮層和視網(wǎng)膜感覺(jué)層組成，兩層間在病理情況下可分開(kāi)，稱為視網(wǎng)膜脫離。色素上皮層與脈絡(luò)膜緊密相連，由色素上皮細(xì)胞組成，它們具有支持和營(yíng)養(yǎng)光感受器細(xì)胞、遮光、散熱以及再生和修復(fù)等作用。組織學(xué)上視網(wǎng)膜分為10層，由外向內(nèi)分別為：色素上皮層、視錐、視桿細(xì)胞層、外界膜、外顆粒層、外叢狀層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)界膜。視網(wǎng)膜內(nèi)層為襯于血管膜內(nèi)面的一層薄膜，有感光作用；后部鼻側(cè)有一視神經(jīng)。視網(wǎng)膜上的感覺(jué)層是由三個(gè)神經(jīng)元組成。神經(jīng)元是視細(xì)胞層，專司感光，它包括錐細(xì)胞和桿細(xì)胞。視桿細(xì)胞主要在離中心凹較遠(yuǎn)的視網(wǎng)膜上，而視錐細(xì)胞則在中心凹處多。層叫雙節(jié)細(xì)胞，約有10到數(shù)百個(gè)視細(xì)胞通過(guò)雙節(jié)細(xì)胞與一個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相聯(lián)系，負(fù)責(zé)聯(lián)絡(luò)作用。第三層叫節(jié)細(xì)胞層，專管傳導(dǎo)。視網(wǎng)膜是一層菲薄的但又非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它貼于眼球的后壁部，傳遞來(lái)自視網(wǎng)膜感受器沖動(dòng)的神經(jīng)纖維跨越視網(wǎng)膜表面，經(jīng)由視神經(jīng)到達(dá)出口。視網(wǎng)膜的分辨力是不均勻的，在黃斑區(qū)，其分辨能力強(qiáng)。它是組成血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞，它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對(duì)維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在視網(wǎng)膜血管的發(fā)病機(jī)制中有重要病理生理學(xué)意義。由于從不同的組織和器官獲得的內(nèi)皮細(xì)胞具有不同的特性，在腦和視網(wǎng)膜中，這些內(nèi)皮細(xì)胞具有內(nèi)屏障的功能，在調(diào)節(jié)血管生理狀態(tài)，釋放血管活性物質(zhì)以及新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用，體外分離培養(yǎng)RCEC對(duì)研究視網(wǎng)膜血管性發(fā)展的病理生理機(jī)制以及的早期防治具有重要臨床意義。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、后通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)CD31熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

實(shí)驗(yàn)具體步驟：

（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)使用無(wú)菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開(kāi)腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過(guò)夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過(guò)夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；

實(shí)驗(yàn)方法:

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

公司正在出售的產(chǎn)品：