細胞簡介：

兔下丘腦神經元細胞分離自下丘腦；下丘腦又稱丘腦下部，位于大腦腹面、丘腦的下方，是調節(jié)內臟活動和活動的較神經所在。下丘腦自前向后可分三部﹐即前部（又名視前區(qū)和視上區(qū)）﹑中部（結節(jié)區(qū)）和后部（體區(qū)）。下丘腦具有許多細胞核團和纖維束﹐與神經系統(tǒng)的其它部位具有密切的相互聯(lián)系。它不僅通過神經和血管途徑調節(jié)腦垂體前﹑后葉的分泌和釋放﹐而且還參與調節(jié)自主神經系統(tǒng)﹐如控制水鹽代謝﹑調節(jié)體溫﹑攝食﹑睡眠﹑生殖、內臟活動以及情緒等。下丘腦神經元與來自其他部位的神經纖維有廣泛的突觸聯(lián)系，可以接受很多神經沖動，為系統(tǒng)和神經系統(tǒng)的中心。它們能調節(jié)垂體前葉功能，合成神經垂體及控制自主神經和植物神經功能。故提取下丘腦神經元進行體外培養(yǎng)，建立下丘腦神經元體外實驗平臺具有重要意義。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基：含B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：神經元細胞樣

傳代特性：屬于終末分化細胞；屬于不增殖細胞群

消化液：0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔下丘腦神經元細胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

方法簡介：

實驗室分離的兔下丘腦神經元細胞采用胰蛋白酶消化法結合神經元培養(yǎng)基培養(yǎng)、化學試劑抑制法篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測：

實驗室分離的兔下丘腦神經元細胞經β-Tubulin-Ⅲ熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

實驗具體步驟：

（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；

根據(jù)細胞數(shù)量種植到對應的培養(yǎng)皿/瓶中；

實驗方法:

一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。

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