實驗方法:
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
細胞簡介：
小鼠肝竇內(nèi)皮細胞細胞分離自肝臟組織；肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個器官，并在身體里面起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用；肝臟也**消化系統(tǒng)中之膽汁。肝臟是機體內(nèi)臟里大的器官，位于機體中的腹部位置，在右側(cè)橫隔膜之下，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方。肝臟是機體消化系統(tǒng)中大的消化腺，為一紅棕色的V字形器官。肝臟是尿素合成的主要器官，又是新陳代謝的重要器官。肝臟在機體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面，大部分肝為肋弓所復(fù)蓋，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁，肝上面則與膈及腹前壁相接。肝竇內(nèi)皮細胞（SEC）是肝臟內(nèi)所占比例的非實質(zhì)細胞，位于肝竇腔與肝細胞之間，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運、吞噬、抗原提呈、耐受等功能。SEC由于擁有一般細胞所沒有的窗孔結(jié)構(gòu)、細胞間連結(jié)松散、內(nèi)皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，從而達到快速交換各種大小分子的目的。肝在遭到多種病原侵襲時，肝竇內(nèi)皮細胞窗孔逐漸減少或消失，內(nèi)皮下基膜形成，產(chǎn)生類似于連續(xù)型的結(jié)構(gòu)，這一過程稱為肝竇化。它由多種因素引起，其過程極復(fù)雜，在多種肝病的發(fā)病前期階段均有出現(xiàn)，近年來受到廣泛關(guān)注。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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肝臟組織 |
5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶 |
A01X1817 |
僅供科研研究實驗 |
培養(yǎng)信息：
包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）
培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長特性 貼壁
細胞形態(tài) 內(nèi)皮細胞樣
傳代特性 可傳1-2代
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡介：
公司實驗室分離的小鼠肝竇內(nèi)皮細胞采用混合酶灌流消化、反復(fù)低速離心、密度梯度離心法，并通過內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
公司實驗室分離的小鼠肝竇內(nèi)皮細胞經(jīng)CD31、CD14熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
小鼠補體蛋白5(C5)elisa分析檢測試劑盒
人假定蛋白LOC677168 elisa分析檢測試劑盒
正常女性人體肝組織微粒體組分（5毫克/毫升）
病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒 50次
大鼠維生素C(VC)elisa檢測試劑盒
小鼠載脂蛋白A1(Apo A1)elisa檢測試劑盒
大鼠核因子κB抑制因子β(IκBβ)elisa檢測試劑盒
細胞ERK1激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）
人胱天蛋白酶8(Casp-8)elisa分析檢測試劑盒
長鏈烯脂酰輔酶A水化酶抗體 ECHS1
脂肪甘油三酯脂酶抗體 Adipose Triglyceride Lipase
鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶1β/CaMKIβ抗體 PNCK
甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶2抗體 DGAT2
IKK激酶相互作用蛋白抗體 IKIP
Ki67蛋白抗體 Ki-67
前列腺相關(guān)蛋白MSMP抗體 MSMP
去泛素化酶15抗體 USP15
APC標記人HLA-DR單克隆抗體 human HLA-DR/APC
B Raf單克隆抗體 BRAF
跨膜蛋白106B抗體 TMEM106B
蛋白激酶A4受體抗體 EphA4 R
X連鎖生長調(diào)控因子GCFX抗體 SHOX
β半乳糖苷酶抗體 Beta galactosidase
細胞凋亡抑制因子3α抗體 Survivin 3 alpha
細胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)亞基1抗體 CKS1
大鼠骨成型蛋白受體Ⅱ(BMPRⅡ)elisa檢測試劑盒
小鼠肝竇內(nèi)皮細胞小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)elisa分析檢測試劑盒
人β2轉(zhuǎn)鐵蛋白(β2TF)elisa檢測試劑盒
Apoptotic protein NDPP 1; Apoptotic protein NDPP1; CARD 8; CARD inhibitor of NF kappa B activating ligand; CARD inhibitor of NF kappaB activating ligand; CARD inhibitor of NF kappaB activating ligands; CARD-inhibitor of NF-kappa-B-activating ligand; CARD8; CARD8_HUMAN; CARDINAL; Caspase recruitment domain containing protein 8; Caspase recruitment domain family member 8; Caspase recruitment domain protein 8; Caspase recruitment domain-containing protein 8; DACAR; NDPP 1; NDPP1; TUCAN; Tumor up regulated CARD containing antagonist of CASP9; Tumor up regulated CARD containing antagonist of caspase 9; Tumor up-regulated CARD-containing antagonist of CASP9; Tumor upregulated CARD containing antagonist of CASP9.
小鼠肝內(nèi)膽管上皮細胞
兔胃平滑肌細胞
GFP標記小鼠成肌細胞;C2C12-GFP
Hs 578T人乳腺癌細胞
實驗具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細胞傳代：當(dāng)單個細胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細胞，消化時間根據(jù)正常細胞消化時間即可，當(dāng)然可以在消化過程中不斷管擦爬出細胞的皺縮情況，一旦達到消化完成（皺縮細胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細胞數(shù)量種植到對應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細胞進行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細胞術(shù)等。