實(shí)驗(yàn)方法:

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

肺巨噬細(xì)胞由單核細(xì)胞分化而來，廣泛分布在肺間質(zhì)內(nèi)，在細(xì)支氣管以下的管道周圍和肺泡隔內(nèi)較多。肺巨噬細(xì)胞的吞噬、和分泌作用都十分活躍，有重要防御功能。吸入空氣中的塵粒、等異物進(jìn)入肺泡和肺間質(zhì)，多被巨噬細(xì)胞吞噬，故細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)常見塵粒、等物進(jìn)入肺泡和肺間質(zhì)，多被巨噬細(xì)胞吞噬，故細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)常見塵粒、次級(jí)溶酶體及吞噬體等。

肺巨噬細(xì)胞還可吞噬衰老的紅細(xì)胞，在心力衰竭患者出現(xiàn)肺瘀血時(shí)，大量紅細(xì)胞從溢出，被巨噬細(xì)胞吞噬。吞噬異物的巨噬細(xì)胞，有的從肺泡腔經(jīng)呼吸道粘液流動(dòng)和纖毛運(yùn)動(dòng)而被咳出，有的進(jìn)入肺管隨進(jìn)入肺結(jié)內(nèi)。

細(xì)胞特性：

1）組織來源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常肺組織。

2)細(xì)胞鑒定：CD68或MAC387熒光染色為陽性。

3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、、酵母和。

5)細(xì)胞生長(zhǎng)方式：圓形，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。

推薦培養(yǎng)基

我們推薦使用 DELF 原代 巨噬 細(xì)胞培養(yǎng)體系 作為體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

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實(shí)驗(yàn)具體步驟：

（1）動(dòng)物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；

（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡(jiǎn)單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺(tái)使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，

利于后期細(xì)胞從組織塊中爬出來，同時(shí)能夠消除部分結(jié)締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個(gè)無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時(shí)，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；

（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個(gè)細(xì)胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達(dá)到傳代的爬出效率；

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量種植到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿/瓶中；