免 疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)：

1、冰凍切片制備

建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。

2、組織切片固定

切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當(dāng)保存。

3、血清封閉

為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般10-30min。

4、一抗孵育條件

在免 疫組化反應(yīng)中重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。

5、二抗孵育條件

二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免 疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。

6、復(fù)染

目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。

7、封片

為了長/期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。

8、切片清洗

為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。